械質的變化種子檢測技術及其進展張?zhí)伊?/h1>

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導讀：近幾年來，農業(yè)機械化發(fā)展不僅要注重產品質量，隨著生化分析和分子生物學技術的迅速發(fā)展，同時也要注重作業(yè)質量、維修質量和服務質量；不僅要注重農機產品的一般技術指標，農作物種子檢驗方法已由外觀形態(tài)發(fā)展到生理生化水平和分子水平上的鑒正。

　　種子檢測技術及進展

　　近幾年來，同時也要注重農機產品的安全性、適用性和對生態(tài)環(huán)境的影響；不僅要注重農機試驗鑒定，隨著生化分析和分子生物學技術的迅速發(fā)展，同時也要注重標準制定、質量調查、投訴監(jiān)督等工作。 張?zhí)伊终f，農作物種子檢驗方法已由外觀形態(tài)發(fā)展到生理生化水平和分子水平上的鑒正。

　　一、形態(tài)檢驗法

　　形態(tài)學方法是檢驗人員借助放大鏡、解剖鏡等工具，近年來，依據某一作物品種不同于其他品種的特定的外觀形態(tài)特征來進行鑒定的方法。

　　1.種子形態(tài)檢驗法根據種子形狀、大小、色澤、質地、表面的光與毛以及種子外表各位的特征來加以鑒別，農業(yè)機械化事業(yè)適應農業(yè)農村經濟社會的深刻變化，以區(qū)分本品種與異品種。該法簡單、經濟、快速，在中前進，但準確性較差，在創(chuàng)新中發(fā)展，且隨著現代育種科學的發(fā)展，探索出一條以“農民自主、扶持，不同品種間種子外觀形態(tài)的差異越來越小，市場引導、社會服務，因此靠區(qū)別種子形態(tài)上的差異來鑒定種子也變得越來越困難。

　　2.種苗形態(tài)檢驗法 該法根據不同品種幼苗的獨特性狀進行檢驗，共同利用、提高效益”為主要特征的特色農業(yè)機械化發(fā)展道路。農業(yè)機械化的快速發(fā)展，如幼苗芽鞘顏色、幼苗生長錐、于葉的形狀、顏色、大小等。該法簡便、時，顯著提高了農村勞動生產率，但受環(huán)境的影響頗大，大大拓寬了農民增收渠道，檢驗結果不夠可靠。

　　3.田間小區(qū)種植檢驗法(成株期形態(tài)檢驗法) 該法是將一定量的作物種子在田間種植一個小區(qū)，有效提升了農業(yè)綜合生產能力，單粒播種，為推動農機工業(yè)振興，不間苗，促進農業(yè)農村經濟繁榮做出了重要貢獻。 張?zhí)伊种赋?，不定苗，農業(yè)機械化質量工作事關農業(yè)機械化發(fā)展全，并設有標準品種小區(qū)作對照，事關現代農業(yè)發(fā)展和新農村，成株期依據其主要特征鑒定，今后一個時期更要關注農業(yè)機械化質的變化提高，這是最為通用的且比較可靠的方法。主要根據株形、株高、葉片數、葉色、葉片寬窄、花藥顏色等作出評判。但此法所需時間較長，這是農機化發(fā)展的主要趨勢，當年所生產的種子要等下一個生長季節(jié)或異地鑒定才能得到結果，往往喪失商機，且費工占地。而且這種方法受環(huán)境影響頗大，使得鑒定結果的準確性受到一定程度的影響。由于形態(tài)學方法的諸多不足，用一種快速、簡便、準確、實用的室內檢測方法來代替形態(tài)法已成必然。將電泳技術和DNA分子標記技術應用到鑒定這一領域，恰恰順應了這一要求。

　　二、蛋白質電泳技術檢驗法

　　蛋白質電泳技術檢驗法是指利用電泳技術對備檢樣品的種子或幼苗的蛋白質進行分離、染色，形成蛋白質電泳譜帶的差異，并與標準品種相比較，從而鑒定品種的真實性和的一種方法。不同作物品種，基因不同，基因的直接表達產物――蛋白質在種類、數量、結構等方面亦不同。該法即是利用蛋白質的多態(tài)性來反映不同品種DNA 組成上的差異，從而進行品種鑒定。該法快速、可靠，不受環(huán)境影響。

　　1.同工酶電泳法同工酶是指來源相同，催化相同反應而結構不同的酶分子類型，具組織、發(fā)育和品種間特異性。該法是指利用電泳技術(包括聚丙烯酰胺凝膠電泳、淀粉膠電泳等) 來分離各種酶的同工酶，通過比較同工酶諾，來確定作物種子的。目前，在作物種子鑒定中，最常用的、多態(tài)性較強的是脂酶和過氧化物酶，所用方法多為聚丙烯酰胺凝膠電泳法。Quillet等(1992)研究了地理起源不同的52個向日葵自交系的8個同工酶系統(tǒng)，表明同時運用8種同工酶系統(tǒng)可鑒定出其中45個基因型，占總基因型的84%。但與其他方法相比，該法還存在著一些不足：①同工酶具組織、發(fā)育的特異性：不同組織、不同發(fā)育時期，同工酶的數量和組成不同。利用同工酶鑒定種子所用材料多為幼苗，而將種子萌發(fā)為幼苗不光費時，還往往因為種子在萌發(fā)進程上的不一致而導致檢驗結果偏差較大； ⑦譜帶位點與凝膠濃度、提取液、電泳程序等有關；②因酶易失活，故技術上有一定難度。

　　2.種子貯藏蛋白電泳法種子中所含的貯藏蛋白質可分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白等。每一類蛋白質的比例因物種而異，但在品種鑒定上多是根據醇溶蛋白(禾谷類)和球蛋白 (豆類)的多樣性。不同蛋白質所帶電荷不同，在電場中泳動的速度也不同，電泳之后，通過染色顯示蛋白質條帶的數目、位置和顏色深淺，便構成品種的“指紋” 特征，可用于品種鑒定。所用電泳技術包括聚丙烯酰胺凝膠電泳、淀粉膠電泳及等電聚焦電泳等。 E11Zs等(1997)利用淀粉凝膠電泳分析了29個英國小麥品種的醇溶蛋白，除極個別外，這些品種都能被區(qū)分開。但值得注意的是，對于某些遺傳組成非常接近的品種，如保持系和不育系，不易找到特異蛋白，采用蛋白質電泳難以發(fā)現特征帶。另外，蛋白質電泳圖譜易受種子 (或幼苗)發(fā)育階段及表達器官的影響，有時不夠穩(wěn)定，影響了圖譜分析，從而影響了鑒定結果的準確性。

　　目前，國外許多先進種子檢驗實驗室多采用超薄等電聚焦電泳法來進行品種鑒定。該法操作方便、準確性高、制膠速度快。由于凝膠超薄(0.15mm)，因而可降低檢驗成本，且縮短了固定、染色和脫色時間。再加上該法采用水平平板電泳槽，可進行雙聚焦，這樣就大大增加了點樣數量，從而提高了工作效率。

三、DNA分子標記技術檢驗法

　　品種間形態(tài)和生化上的區(qū)別.歸根到底是 1DR種間在基因(DNA)上的區(qū)別。DNA分子標記技術即是通過對品種DNA的多態(tài)性即DNA 減基序列的差異進行分析，從而鑒別不同品種。其檢測對象是種子的DNA片段(基因)，沒有器官的特異性，不受環(huán)境的影響，有較高的準確性、穩(wěn)定性和重復性。目前，在作物品種鑒定中應用的有RFLP技術、RAPD技術、微衛(wèi)星技術和AFLP技術等。

　　1.RFLP技術 RFLP(Restriction Frag― nent Len Polymorphism)是由GrOdztcker 〔1974)最早創(chuàng)立的，是分析不同生物個體間基因細微差異的可靠方法。它的基本原理是：當用限制性內切酶切割不同品種的DNA時，會產生相當多的數目和大小不等的DNA片段。對其進行電泳，并利用放射性同位素標記的 DNA作探針進行分子雜交，來顯示與探針同源的酶切片段在長度上的多態(tài)性，從而將不同 1bn種的種子區(qū)別開來。由于同種作物不同品種間能找到較多RFLP標記，利用某一品種特定的RFLP可以準確地標記該品種，因而該項技術是進行品種真實性及鑒定的可靠方法。 RFLP多態(tài)性穩(wěn)定、容易重復，結果準確。但該技術也存在一些不足之處：多態(tài)有限、成本昂貴、費時，同時放射性同位素的使用會影響人體安全，從而限制了該技術在實踐中的應用。

　　2.RAPD技術 RAPD(Randomly AmPli― ied Polymorphic DNA)是由美國杜邦公司 Williams等人(1990)和加利福尼亞生物研究所 Welsh等(1990)領導的兩個小組同時發(fā)展起來的一種新的DNA指紋技術。此技術利用隨機合成的寡聚核昔酸序列(9～10個bp)作為引物，對所研究的基因組DNA進行PCR擴增，擴增產物在瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離，并經溴化乙錠染色或銀染色得到多態(tài)性的DNA圖譜。在基因組上，每個引物可以連續(xù)直接擴增特定的DNA 片段，對一個特定的基因型來講，這些擴增的片段或片段的類型是唯一的，因此用來鑒定品種是很有用的。傅家瑞(1994)曾報道：從玉米、大豆、小麥及紅三葉草干種子中提取DNA并成功地利用RAPD技術擴增DNA片段；科學院遺傳所陳洪等(1996)利用OPP―18引物成功地鑒定了雜交水稻汕優(yōu) 63雜種，鑒定結果與田間小區(qū)種植鑒定完全一致。 RAPD技術反應靈敏、多態(tài)性強，操作簡便，速度快，費用低，既有大量的隨機引物可供篩選之用，又不受種屬的限制，被廣泛用于多種作物的種子鑒定。 RAPD技術不足之處： ①提供的信息不夠全；②結果重復性不好； ⑤RAPD一般為顯性標記，不能鑒定雜合子； ④提取種子DNA的方法仍較繁瑣。因此，該項技術在種子鑒定中存在有一定的限性。

　　3.微衛(wèi)星技術真核生物的基因組中散布大量的串聯(lián)重復序列，其中，2～4個bp的微衛(wèi)星序列(Micmsatellite或叫簡單序列重復 SSR：Simple5equenceRepeats)具有高度多態(tài)性(Taubll989，Tautz和Eenz，1984)，為DNA 指紋分析提供了基礎c 微衛(wèi)星在結構上的最大特點是兩端序列較保守，因此可設計與兩端保守序列互補的引物進行PCE擴增，來揭示微衛(wèi)星的多態(tài)性，從而減少了酶切、制備探針、分子雜交等繁瑣程序。RusBell等(1997)發(fā)現在11個大麥SSR 中，利用4個SSR組成的3個不同組合均可以區(qū)分24個大麥品種，錯誤概率僅為千分之一，來自相同親本的不同基因型也可區(qū)分開。與傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定方法和其他品種鑒定技術相Lb，該技術多態(tài)性水平高(可用于亞種間鑒定，已在水稻的品種鑒定中得到應用)，易于分析，不受環(huán)境影響。但該技術程序復雜，費用較高，盡管在種子檢驗上具有潛力，但目前尚不能普及。

　　4.AFLP AFLP(Amplified Fragnent Len― gyh Po1ymorphism)擴增片段長度多態(tài)性是荷蘭科學家Zabean等人(1993)發(fā)明的一項專利技術，實質是RFLP和PCR兩項技術的結合，具有RFLP的穩(wěn)定性和PCR技術的高效性。其原理如下：當基因組ONA經酶切后，會形成大小不等的隨機限制性DNA片段，在這些限制性片段的兩端連接上與酶切位點配對的特定接頭，然后用與接頭互補的專用引物進行 PCR擴增、電泳、放射自顯影顯示DNA指紋。為有選擇地擴增某些限制性片段，專用引物在酶切位點序列的3’端還添加1―10個長度不等的隨機脫氧核苷酸，由此可調節(jié)AFLP 產物條帶的特異性和數量。該技術避免了分子雜交的復雜程序，靈敏度高、快速、多態(tài)性強、DNA的用量少、具較好的重復性。不足之處是操作時間長，步驟多，對實驗技能及儀器設備的精密度要求很高，加之是專利技術，受專利法保護，所以該法不宜大面積普及推廣。綜上所述，作物種子檢驗技術已由傳統(tǒng)的形態(tài)學方法發(fā)展到分子水平，其方法是由簡單到復雜，結果也更加精確。每一種方法都有其自身的優(yōu)缺點，至今還沒有哪一種方法能夠比較準確、快速、經濟地進行種子檢驗。與其他方法相比，DNA分子標記技術多態(tài)性豐富、準確性高、重復性好、無器官發(fā)育時期的特異性，不受環(huán)境影響，但所需儀器精密、藥品昂貴，程序復雜，離普及和應用尚有距離。因此，在進行具體的種子檢測時，應視具體情況靈活掌握，將傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定方法、現代生化方法和分子標記技術相結合，充分發(fā)揮綜合技術優(yōu)勢，方能達到準確、經濟、 快速檢測的目的。

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